Phân tích dấu ấn/CD/marker miễn dịch máu ngoại vi, hoặc dịch khác bằng kỹ thuật flow cytometer (làm cho một dấu ấn/CD/marker ) - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

• Cùng với sự phát triển của tế bào tạo máu, các quần thể tế bào máu thuộc từng dòng khác nhau và các lứa tuổi khác nhau mang những đặc điểm dấu ấn miễn dịch (còn gọi là các marker hay các CD) khác nhau. Ví d CD45 là kháng nguyên bạch cầu chung, có trên bề mặt tất cả các tế bào bạch cầu trưởng thành. Ở giai đoạn non, bạch cầu có thể dương tính yếu hoặc m tính với CD45. Các dấu ấn miễn dịch non khác như CD34, HLA-DR, TdT gặp ở những tế bào non. Các dấu ấn đặc trưng cho d ng tủy chung có CD13, CD33, CD15, CD117, MPO...; cho dòng mono có thêm CD14, CD16; cho d ng h ng cầu có thêm CD123a, CD71; cho d ng tiểu cầu có thêm CD41, CD61. Các dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho d ng lympho B có CD10, CD19, CD20, CD22...; cho d ng lympho T có CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD3, CD8....
• Trên phân tích tế bào d ng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45 sau ly giải h ng cầu sẽ ph n bổ trên đ thị SS vs CD45 thành 3 vùng quần thể r rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.
• Các quần thể tế bào blast ác tính thường xuất hiện trong vùng cửa sổ blast (trên đ thị SS vs CD45), và/hoặc có các đặc điểm không đ ng bộ về kháng nguyên (xuất hiện đồng thời các kháng nguyên thuộc đặc trưng các dòng tế bào khác nhau, xuất hiện đ ng thời các kháng nguyên thuộc các giai đoạn phát triển khác nhau của cùng 1 d ng tế bào), xuất hiện kháng nguyên quá mức, giảm hoặc mất biểu hiện một kháng nguyên nào đó. Trong quá trình biệt hóa, các tế bào máu có s xuất hiện hoặc là mất đi các dấu ấn miễn dịch. Mỗi một d ng tế bào, một giai đoạn tế bào sẽ có những dấu ấn miễn dịch đặc trưng. V v y, có thể căn cứ vào sự có mặt hoặc không có mặt các dấu ấn miễn dịch có thể xác định được d ng tế bào và giai đoạn biệt hóa của tế bào ung thư trong Lơ xê mi cấp.
• Bằng cách sử d ng các kháng thể đơn d ng chống lại các dấu ấn miễn dịch đặc hiệu và phân tích trên máy Flow cytometry có thể ph n tích được kiểu h nh miễn dịch của một loại tế bào nào đó, xác định được tế bào ung thư máu thuộc dòng nào và giai đoạn biệt hóa nào.

II. CHỈ ĐỊNH

•  Lơ xê mi cấp (nếu không lấy được tủy xương).
•  Lơ xê mi kinh (nếu không lấy được tủy xương).
•  Đa u tủy xương (nếu không lấy được tủy xương).
•  Rối loạn sinh tủy (nếu không lấy được tủy xương).
•  Rối loạn tăng sinh d ng lympho.
•  Suy giảm miễn dịch bẩm sinh.
•  Suy giảm miễn dịch thứ phát (sau nhiễm HIV, sau điều trị hóa chất, sau nhiễm trùng nặng...).
•  Nghi ngờ khối u th m nhiễm thần kinh trung ương, khoang màng phổi, khoang màng b ng...

III.CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  Kỹ thuật viên và cử nh n đã được đào tạo: th c hiện k thu t.
•  Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

• Máy phân tích tế bào dòng chảy (máy flow cytometer);
• Máy ly tâm;
• Máy lắc trộn;
• Pipet man và đầu pipet loại 250 μl và 1.000 μl;
• Ống nghiệm flow cytometry (chuyên d ng cho máy ph n tích tế bào d ng chảy).

2.2. Hóa chất

•  Anti CD45-PC5 (có thể sử d ng màu huỳnh quang khác như PerPC5.5, PC, ECD...).
•  kháng thể kháng 1 CD định khảo sát có gắn mầu huỳnh quang khác với màu huỳnh quang của kháng thể anti CD45 (ví d CD33-PE).
•  Dung dịch ly giải hồng cầu.
•  Dung dịch sheath chạy máy flow.
•  Dung dịch đệm PBS.

2.3. Hóa chất, vật tư khác

Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite, găng tay.

3. Bệnh phẩm

 Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDT hoặc mẫu dịch chọc hút (màng phổi, màng b ng, dịch khớp...). Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ lơ xê mi cấp hoặc các bệnh lý huyết học lành tính và ác tính khác. Tuy nhiên trong một số trường hợp nhất định có thể lấy mẫu từ các người bệnh có t nh trạng bệnh lý khác (nhiễm trùng, nhiễm HIV, suy giảm miễn dịch...) tùy thuộc vào m c đích khảo sát của bác sĩ lâm sàng.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

• 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDT .
• Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong v ng 6 giờ sau lấy mẫu.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị mẫu

•  Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu, điều chỉnh số lượng bạc cầu về 1 x 106 tế bào/ml.
•  Lấy 100 μl máu đã điều chỉnh số lượng tế bào cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.
•  Ly giải h ng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải h ng cầu, ủ nhiệt độ ph ng trong 10 phút.
•  Ly t m rửa huyền dịch tế bào sau ly giải h ng cầu 2 lần, mỗi lần làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly t m 2000v ng/phút trong 3 phút. Đổ b dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch c n lại (khoảng 100 μl). Trộn đều cặn và lượng dịch c n lại.

2.2. Ủ kháng thể

• Cho kháng thể anti CD45-PC5, kháng thể kháng dấu ấn miễn dịch cần khảo sát (ví d CD33-PE) (mỗi loại 20 ul) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá h ng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ ph ng 20 phút, tránh ánh sáng.
• Rửa b kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly t m 2.000 v ng/phút trong 3 phút. Đổ b dịch nổi, để lại cặn tế bào.
• Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho ph n tích.

2.3. Ph n tích trên máy flow cytometry

• Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.
• Mở chương tr nh ph n tích dấu ấn miễn dịch đa màu đã l p sẵn trên máy. Nh p vị trí ống ph n tích và chạy chương tr nh phần mềm ph n tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

• Quy ước: với mỗi một CD nếu tỷ lệ dương tính trên 20% th được gọi là dương tính với CD đó.
• Khi ph n tích chủ yếu t p trung ph n tích quần thể tế bào blast(nếu có). Trong một số trường hợp c thể (không phải bệnh máu ác tính), cần ph n tích thêm các quần thể bạch cầu hạt, lympho, mono.
• Nếu quần thể blast dương tính với các dấu ấn d ng tủy như CD13, CD33... th chẩn đoán là ung thư d ng tủy. Nếu dương tính với CD2, CD3, CD7, CD4, CD8... th chẩn đoán là ung thư d ng lympho T. Nếu dương tính với các dấu ấn d ng lympho B như CD19, CD20CD22, CD79a... th chẩn đoán là ung thư d ng lympho B. Nếu chỉ dương tính với CD34 th chẩn đoán là ung thư tế bào gốc tạo máu chưa ph n thể.
• Nếu không phải mẫu của người bệnh ung thư máu, tùy theo ý định của bác s điều trị sẽ ph n tích tỷ lệ % hoặc số lượng tuyệt đối (số tế bào/microlit) tế bào có mang một đặc điểm miễn dịch nhất định.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x t nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

• Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá l u th phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương tr nh chạy (Phải căn cứ vào đ thị SS và CD45, căn cứ vào s ph n bổ r rệt của các quần thể tế bào trên đ thị này và căn cứ vào quần thể tế bào lympho b nh thường để xác định mức độ ch ng lấp màu. Ở một mẫu máu b nh thường, quần thể tế bào ph n định thành 3 vùng r rệt là vùng bạch cầu hạt, vùng lympho và vùng mono). Nguyên nh n có thể do th c hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, th c hiện không đủ các bước của quy tr nh, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy...

• Xử trí: Làm lại x t nghiệm và tu n thủ theo đúng quy tr nh. Kiểm tra máy trước khi ph n tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.