Phân tích dấu ấn/CD/marker miễn dịch tủy xương bằng kỹ thuật flow cytometer (làm cho một dấu ấn/CD/marker ) - Bộ y tế 2017

I. NGUYÊN LÝ

•  Cùng với s phát triển của tế bào tạo máu, các quần thể tế bào máu thuộc từng d ng khác nhau và các lứa tuổi khác nhau mang những đặc điểm dấu ấn miễn dịch (c n gọi là các marker hay các CD) khác nhau. Ví d CD45 là kháng nguyên bạch cầu chung, có trên bề mặt tất cả các tế bào bạch cầu trưởng thành. Ở giai đoạn non, bạch cầu có thể dương tính yếu hoặc m tính với CD45. Các dấu ấn miễn dịch non khác như CD34, HLA-DR, TdT gặp ở những tế bào non. Các dấu ấn đặc trưng cho d ng tủy chung có CD13, CD33, CD15, CD117, MPO...; cho d ng mono có thêm CD14, CD16; cho d ng h ng cầu có thêm CD123a, CD71; cho d ng tiểu cầu có thêm CD41, CD61. Các dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho d ng lympho B có CD10, CD19, CD20, CD22...; cho d ng lympho T có CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD3, CD8....
•  Trên ph n tích tế bào d ng chảy, tế bào tủy ủ với anti CD45 sau ly giải h ng cầu sẽ ph n bổ trên đ thị SS vs CD45 thành 3 vùng quần thể r rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.
•  Các quần thể tế bào blast ác tính thường xuất hiện trong vùng cửa sổ blast (trên đ thị SS vs CD45), và/hoặc có các đặc điểm không đ ng bộ về kháng nguyên (xuất hiện đ ng thời các kháng nguyên thuộc đặc trưng các d ng tế bào khác nhau, xuất hiện đ ng thời các kháng nguyên thuộc các giai đoạn phát triển khác nhau của cùng 1 d ng tế bào), xuất hiện kháng nguyên quá mức, giảm hoặc mất biểu hiện một kháng nguyên nào đó. Trong quá tr nh biệt hóa, các tế bào máu có s xuất hiện hoặc là mất đi các dấu ấn miễn dịch. Mỗi một d ng tế bào, một giai đoạn tế bào sẽ có những dấu ấn miễn dịch đặc trưng. V v y, có thể căn cứ vào s có mặt hoặc không có mặt các dấu ấn miễn dịch có thể xác định được d ng tế bào và giai đoạn biệt hóa của tế bào ung thư trong Lơ xê mi cấp.
•  Bằng cách sử d ng các kháng thể đơn d ng chống lại các dấu ấn miễn dịch đặc hiệu và ph n tích trên máy Flow cytometry có thể ph n tích được kiểu h nh miễn dịch của một loại tế bào nào đó, xác định được tế bào ung thư máu thuộc d ng nào và giai đoạn biệt hóa nào.

II. CHỈ ĐỊNH

• Lơ xê mi cấp;
• Lơ xê mi kinh;
• Đa u tủy xương;
• Rối loạn sinh tủy;
• Rối loạn tăng sinh d ng lympho;
• U lympho không Hodgkin;
• U lympho Hodgkin.

III. CHỐNG CHỈ Đ NH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

•  K thu t viên và cử nh n đã được đào tạo: th c hiện k thu t.
•  Bác s x t nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

• Máy ph n tích tế bào d ng chảy (máy flow cytometer).
• Máy ly t m.
• Máy lắc trộn.
• Pipet man và đầu pipet loại 250 μl và 1.000 μl.
• Ống nghiệm flow cytometry (chuyên d ng cho máy ph n tích tế bào d ng chảy).

2.2.Hóa chất chính

• Anti CD45-PC5 (có thể sử d ng màu huỳnh quang khác như PerPC5.5, PC, ECD...).
• Kháng thể kháng 1 CD định khảo sát có gắn mầu huỳnh quang khác với màu huỳnh quang của kháng thể anti CD45 (ví d CD33-PE).
• Dung dịch ly giải h ng cầu.
• Dung dịch sheath chạy máy flow.
• Dung dịch đệm PBS.

2.3 Hóa chất, vật tư khác

 Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite, găng tay.

3. Bệnh phẩm

• Là mẫu dịch hút tủy xương chống đông bằng EDT , hoặc mẫu nghiền từ hạch.
• Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ lơ xê mi cấp, u lympho hoặc các bệnh lý huyết học lành tính và ác tính khác.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

•  1-2 ml dịch hút tủy xương chống đông bằng EDT .
•  Trường hợp là mẩu sinh thiết hạch, cần khoảng bằng 1⁄2 hạt gạo.
•  Mẫu cần được gửi đến ph ng x t nghiệm flow cytometry ngay trong v ng 6 giờ sau lấy mẫu.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Xử lý mẫu

•  Nếu là mẫu hạch: nghiền mẫu với 2 ml dung dịch PBS bằng d ng c nghiền mẫu. Sau nghiền đem lọc huyền dịch tế bào qua lưới nylon mịn để loại b tổ chức xơ sợi. Chỉnh huyền dịch tế bào sau lọc về n ng độ khoảng 1 x 106 tế bào/ml.
•  Nếu là mẫu dịch hút tủy xương: Lọc dịch hút tủy xương qua lưới nylon mịn để loại b tổ chức xơ sợi, mỡ, và các mảnh v n xương (nếu có). Chỉnh huyền dịch tế bào sau lọc về n ng độ khoảng 1 x 106 tế bào bạc cầu/ml.

2.2. Chuẩn bị mẫu

•  Lấy 100 μl mẫu đã chuẩn bị cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.
•  Ly giải h ng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải h ng cầu, ủ nhiệt độ ph ng trong 10 phút (với mẫu hạch không cần làm bước ly giải mà chuyển thẳng tới bước ủ kháng thể.
•  Ly t m rửa huyền dịch tế bào sau ly giải h ng cầu 2 lần, mỗi lần làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly t m 2000v ng/phút trong 3 phút. Đổ b dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch c n lại (khoảng 100 μl). Trộn đều cặn và lượng dịch c n lại.

2.3. Ủ kháng thể

• Cho kháng thể anti CD45-PC5, kháng thể kháng dấu ấn miễn dịch cần khảo sát (ví d CD33-PE) (mỗi loại 20 ul) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá h ng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ ph ng 20 phút, tránh ánh sáng.
• Rửa b kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly t m 2.000 v ng/phút trong 3 phút. Đổ b dịch nổi, để lại cặn tế bào.
• Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho ph n tích.

2.4. Phân tích trên máy flow ytometry

• Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.
• Mở chương tr nh ph n tích dấu ấn miễn dịch đa màu đã l p sẵn trên máy. Nh p vị trí ống ph n tích và chạy chương tr nh phần mềm ph n tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

• Quy ước: với mỗi một CD nếu tỷ lệ dương tính trên 20% th được gọi là dương tính với CD đó.
• Khi ph n tích chủ yếu t p trung ph n tích quần thể tế bào blast(nếu có). Trong một số trường hợp c thể (không phải bệnh máu ác tính), cần ph n tích thêm các quần thể bạch cầu hạt, lympho, mono.
• Nếu quần thể blast dương tính với các dấu ấn d ng tủy như CD13, CD33... th chẩn đoán là ung thư d ng tủy. Nếu dương tính với CD2, CD3, CD7, CD4, CD8... th chẩn đoán là ung thư d ng lympho T. Nếu dương tính với các dấu ấn d ng lympho B như CD19, CD20, CD22, CD79a... th chẩn đoán là ung thư d ng lympho B. Nếu chỉ dương tính với CD34 th chẩn đoán là ung thư tế bào gốc tạo máu chưa ph n thể.
• Nếu không phải mẫu của người bệnh ung thư máu, tùy theo ý định của bác s điều trị sẽ ph n tích tỷ lệ % hoặc số lượng tuyệt đối (số tế bào/microlit) tế bào có mang một đặc điểm miễn dịch nhất định.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ X TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x t nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

• Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá l u th phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương tr nh chạy (Phải căn cứ vào đ thị SS và CD45, căn cứ vào s ph n bổ r rệt của các quần thể tế bào trên đ thị này và căn cứ vào quần thể tế bào lympho b nh thường để xác định mức độ ch ng lấp màu. Ở một mẫu máu b nh thường, quần thể tế bào ph n định thành 3 vùng r rệt là vùng bạch cầu hạt, vùng lympho và vùng mono). Nguyên nh n có thể do th c hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, th c hiện không đủ các bước của quy tr nh, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy...

• Xử trí: Làm lại x t nghiệm và tu n thủ theo đúng quy tr nh. Kiểm tra máy trước khi ph n tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.